Pagrindinės genų terapijos produktų virusų pašalinimo patvirtinimo tyrimo protokolų projektavimo nuostatos

ICH Q5A(R2)-Tarptautinis derinimo fondas

ICH Q5A(R2) buvo oficialiai priimtas 2023 m. lapkričio 1 d. ir yra pagrindinis tarptautinis virusinės saugos vertinimo dokumentas. Palyginti su 1999 m. paskelbtu Q5A(R1), svarbūs R2 versijos atnaujinimai apima: naujai pridėtą skyrių apie virusinės saugos vertinimą nuolatinėje gamyboje (7 skyrius); sustiprintas rizikos vertinimo, kaip virusų pašalinimo strategijų pagrindo, vaidmuo; naujos kartos sekos (NGS) įtraukimas į virusų aptikimą; ir aiškūs naujų produktų ir gamybos procesų vertinimo reikalavimai. Q5A(R2) patvirtino reguliavimo institucijos, įskaitant FDA, EMA ir PMDA, suteikdamos vieningą techninę sistemą virusų pašalinimo patvirtinimui visame pasaulyje.

NMPA{0}}Kinijos reguliavimo sistema

NMPA virusinės saugos reguliavimo sistema apima kelis lygius:

Dokumento lygis	Dokumento pavadinimas	Išleidimo metai
Pagrindinis dokumentas	Virusų pašalinimo/inaktyvavimo iš kraujo produktų techninės gairės	2002
Pagrindinis dokumentas	Bendrieji biologinių audinių-išvestinių produktų ir eukariotinių ląstelių{1}}išreikštų produktų virusinės saugos įvertinimo techninės peržiūros bendrieji principai	2005
Konkrečios produkto-gairės	Rekombinantinio adeno{0}}susijusio viruso (rAAV) vektorių-pagrįstų in vivo genų terapijos produktų farmacinių tyrimų ir klinikinių tyrimų taikymo techninės gairės	2023
Konkrečios produkto-gairės	Rekombinantinio adeno{0}}susijusio viruso (rAAV) vektorių-pagrįstų in vivo genų terapijos produktų, skirtų rinkodaros leidimo paraiškoms, bendrieji techniniai reikalavimai	2025
Inovatyvus vadovas	Techninės virusų pašalinimo procesų platformos patvirtinimo gairės, skirtos terapinių rekombinantinių baltymų produktų klinikiniams tyrimams (bandymas)a	2024

a: Šios gairės yra pirmas kartas, kai Kinijos reguliavimo institucija nustato sistemingus techninius reikalavimus, taikomus virusų pašalinimo procesų platformos patvirtinimui, ir yra suderintos su ICH Q5A(R2) dvasia.

FDA ir EMA{0}}JAV ir Europos reguliavimo reikalavimai

2024 m. sausio mėn. FDA oficialiai išleido pramonės rekomendacijų dokumentą, pagrįstą ICH Q5A(R2). Be to, Jungtinių Valstijų farmakopėjos (USP) skyrius<1050.1>pateikiamos papildomos techninės gairės dėl virusų šalinimo procedūrų projektavimo, įvertinimo ir apibūdinimo. FDA kas dvejus metus organizuoja virusų šalinimo simpoziumą; 2023 m. simpoziume buvo nagrinėjamos pažangiausios temos, pvz., nauji būdai, nuolatinė gamyba, naujos chromatografijos terpės ir adsorbciniai filtrai. Pagrindiniai EMA gairių dokumentai apima CPMP/BWP/268/95 (Pastaba dėl virusų patvirtinimo tyrimų rekomendacijų: virusų inaktyvavimo ir pašalinimo patvirtinimo planas, indėlis ir interpretacija) ir EMEA/CHMP/BWP/398498/2005 medicinos saugos tyrimų linija dėl virusų saugos. Produktai), kurie abu buvo suderinti su ICH Q5A(R2).

Virusinės taršos šaltinių nustatymas

ICH Q5A(R2) pabrėžia, kad viruso pašalinimo patvirtinimo planas turėtų būti pagrįstas išsamiu rizikos vertinimu. Genų terapijos produktų atveju, nustatant virusinės taršos šaltinius, reikėtų atsižvelgti į šiuos lygius:

Ląstelių banko lygis: endogeniniai virusai (pvz., retrovirusinės dalelės) ir latentiniai infekciniai virusai, potencialiai esantys gamybos ląstelių substratuose (pvz., HEK293, CHO, HeLa). Yra žinoma, kad HEK293 ląstelėse yra endogeninės Ad5 E1 sekos ir maždaug 900 bp EBV fragmentas ir jos gali ekspresuoti kompetentingą adenovirusą; todėl vertinant riziką šiai rizikai turėtų būti skiriamas ypatingas dėmesys.

Pagalbinio viruso lygis: AAV vektoriaus gamyboje paprastai naudojami tokie metodai kaip triguba transfekcija, naudojant pagalbines plazmides, dėl kurių kyla pavojus, kad gali atsirasti replikacijos-kompetentingas adenovirusas (RCA). Panašiai pakavimo ląstelės, naudojamos lentivirusinio vektoriaus gamyboje, gali generuoti replikacijos -kompetentingą lentivirusą (RCL).

Žaliavų lygis: atsitiktiniai virusai gali būti patekę per gamyboje naudojamas žaliavas, įskaitant ląstelių auginimo terpę, pašarus ir fermentus. Ši rizika ypač didelė, kai naudojami gyvūninės kilmės komponentai (pvz., galvijų vaisiaus serumas, tripsino virškinimo tirpalai).

Rizikos skirtumai: genų terapija ir tradiciniai rekombinantiniai baltymai

Rizikos dimensija	Tradiciniai rekombinantiniai baltymų produktai	Genų terapijos produktai
Viruso šaltinis	Endogeniniai virusai iš ląstelių banko; atsitiktiniai virusai	Ląstelių banko virusai; pagalbiniai virusai; replikacijos{0}}kompetentingi vektoriai (RCV/RCL); šeimininko genomo integracija
Ląstelių substratas	CHO, NS0, Sp2/0 ir kitos gerai{3}}apibūdintos ląstelių linijos	HEK293, HeLa, CHO ir kt.; kai kurios ląstelių linijos yra navikinės kilmės
Produkto charakteristikos	Baltyminis{0}} vaistas; gerai-apibrėžta struktūra	Virusinis vektorius; kelia pavojų biologiniam saugumui
Patvirtinimo strategija	Kelių{0}}pakopų viruso pašalinimas; akcentuojamas proceso žingsnio patvirtinimas	Reikalingas RCV/RCL aptikimas; patvirtinimas ir testavimas yra būtini
Platformos patvirtinimas	Taikoma nusistovėjusiems procesams, tokiems kaip S/D, žemas pH, nanofiltravimas	Ribotas pritaikymas dėl vektorių tipų įvairovės

1 lentelė. Virusinės saugos rizikos palyginimas: genų terapijos produktai ir tradiciniai rekombinantiniai baltymų produktai

Bendrieji principai

Indikatoriaus viruso parinkimas yra pagrindinis elementas kuriant viruso pašalinimo patvirtinimo protokolus. ICH Q5A(R2) reikalauja, kad indikatorinio viruso atranka būtų pagrįsta rizikos vertinimu ir būtų atsižvelgta į šiuos veiksnius:

Viruso reikšmė gamybos ląstelės substratui (atitinkamas virusas)

Viruso fizikinės ir cheminės savybės (apvalkalas/ne{0}}apvalkalas, DNR/RNR, dydžio diapazonas)

Viruso atsparumas fiziniam/cheminiam apdorojimui

Viruso aptikimas ir biologinis saugumas

Genų terapijos produktams, parenkant indikatorinį virusą, reikia papildomai atsižvelgti į: paties vektoriaus viruso, kaip „atitinkamo viruso“ vaidmenį; galimas pagalbinio viruso užkrėtimo pavojus; ir kompetentingų virusų (RCV/RCL) aptikimo ir patvirtinimo reikalavimus.

Rekomenduojamas indikatoriaus virusų skydelis

Virusas	Tipas	Vokas	Genomas	Dydis (nm)	Pasirinkimo pagrindimas / taikymas
MVM	Parvovirusas	Nėra	ssDNA	18–26	Ne{0}}apgaubtas modelis; mažiausias dydis ir didžiausias atsparumas; tinkamas nanofiltravimo patvirtinimui (paprastai netaikomas rAAV vektoriniams produktams)
PPV	Parvovirusas	Nėra	ssDNA	18–26	Ne{0}}apgaubtas modelis; dažniausiai naudojamas kraujo produktų indikatorinis virusas
Reo-3	Reovirusas	Nėra	dsRNR	60–80	Ne{0}}apgaubtas modelis; vidutinio dydžio; didelis fizinis stabilumas
PRV	Herpesviridae	Taip	dsDNR	150–200	Modelis su voku; didelis dydis; platus šeimininkų asortimentas
X-MuLV	Retrovirusas	Taip	ssRNR	80–110	Apvalaus retroviruso modelis; tinka CHO{0}}išvestiniams ląstelių substratams
BVDV	Flaviviridae	Taip	ssRNR	40–60	Modelis su voku; naudojamas cheminio inaktyvavimo metodams įvertinti (HCV pakaitalas)
VSV	Rhabdoviridae	Taip	ssRNR	70	Modelis su voku; plati pH tolerancija; tinka žemo{0}}pH inaktyvavimo patvirtinimui

2 lentelė. Rekomenduojamas indikatoriaus virusų skydelis genų terapijos produktų viruso pašalinimo patvirtinimui

Specialūs AAV Vector produktų aspektai

Rekombinantinių AAV vektoriaus produktų atveju NMPA techninėse gairėse dėl rAAV vektorių{0}}pagrįstų in vivo genų terapijos produktų farmacinių tyrimų ir klinikinių tyrimų taikymo įvertinimo reikia atkreipti dėmesį į kompetentingo AAV (rcAAV) replikacijos aptikimą. rcAAV reiškia AAV, galinčią autonomiškai replikuotis, kuri paprastai atsiranda dėl homologinės rekombinacijos tarp pagalbinės plazmidės ir produkto AAV genomo. rcAAV aptikimas paprastai atliekamas naudojant infekcinius tyrimus arba qPCR metodus, atliekamus atskirai vaistinei medžiagai ir išgrynintam produktui.

Verta paminėti, kad tolesniuose AAV vektorių produktų gryninimo procesuose paprastai yra nukleazės skaidymas, chromatografija (AEX), nanofiltracija ir jonų mainų chromatografija (CEX/IEX). Atliekant tradicinį viruso pašalinimo patvirtinimą, šie proceso etapai gali sukelti reikšmingų paties AAV vektoriaus praradimo; todėl vektoriaus ir indikatoriaus virusų sąveika turi būti atidžiai apsvarstyta kuriant mastelio-mažinimo modelį. Tam tikrų proceso etapų (pvz., nanofiltravimo), kai AAV vektoriaus nuostoliai yra dideli, reikėtų įvertinti, ar proceso koregavimas yra pagrįstas remiantis patvirtinimo duomenimis (pvz., nanofiltravimo membranos porų dydžio koregavimas).

Bendrieji principai

Mažinimo{0}}modelis (SDM) yra pagrindinis viruso pašalinimo patvirtinimo įrankis; jo konstrukcija turi tiksliai atspindėti gamybos proceso virusų pašalinimo efektyvumą. ICH Q5A(R2) 6.2.2 skirsnyje aiškiai reikalaujama, kad sumažinto mastelio -modelio pagrindiniai parametrai atitiktų gamybos procesą. Kalbant apie genų terapijos produktus, SDM projekte ypač svarbūs šie aspektai:

Kritinių procesų parametrų reprezentatyvumas

Mastelio-mažinimo modelis turi atitikti gamybos procesą šiais parametrais: chromatografinėmis sąlygomis (buferio sudėtimi, pH, laidumu); apkrovos santykis (vektoriaus/supernatanto baltymo masės santykis); kontakto laikas ir temperatūra; srauto greitis / buvimo laikas; produkto grynumas ir sudėtis. AAV produktų atveju taip pat turėtų būti konkrečiai atkreiptas dėmesys į vektoriaus dalelių dydžio pasiskirstymo ir tuščių kapsidų kiekio poveikį nanofiltravimo veikimui.

Modelio kvalifikacijos reikalavimai

ICH Q5A(R2) reikalauja tinkamo mastelio-mažinimo modelio kvalifikacijos, įskaitant: produkto kokybės požymių (pvz., grynumo, regeneravimo, tankio) palyginimą; kritinio proceso parametrų nuoseklumo kvalifikacija; ir užtikrinti, kad mastelio-mažinimo modelis fiksuotų gamybos proceso kintamumą. Atliekant chromatografijos etapus, smailės profilio, eliuavimo ir plovimo konsistencija turėtų būti kvalifikuota; nanofiltravimo etapams turėtų būti patikrintas tūrio pajėgumo ir produkto sudėties poveikis.

LRV skaičiavimo formulė

Log reduction vertė (LRV) yra pagrindinė viruso klirenso veiksmingumo matavimo metrika. ICH Q5A(R2) 6.5 skyriuje pateikiamas išsamus LRV skaičiavimo metodų ir statistinio apdorojimo aprašymas. Pagrindinė LRV skaičiavimo formulė yra tokia: LRV=log₁₀(N₀/N), kur N₀ yra pradinis viruso titras po viruso padidėjimo, o N yra liekamasis viruso titras po apdorojimo procesu. Kai likutinis viruso titras nukrenta žemiau tyrimo aptikimo ribos, reikia naudoti įvertinimo metodus, tokius kaip Puasono pasiskirstymas (pvz., didelio -tūrio tyrimas).

Pasitikėjimo intervalų taikymas

Tiek ICH Q5A(R2), tiek EMA CPMP/BWP/268/95 reikalauja LRV skaičiavimo rezultatų pasikliautinojo intervalo įvertinimo. Paprastai taikomas 95 % pasikliautinasis intervalas.

Veiksmingumo kriterijai

Remiantis NMPA techninėmis gairėmis dėl virusų pašalinimo / inaktyvavimo iš kraujo produktų, viruso sumažėjimas didesnis nei 4 žurnalai rodo, kad proceso veiksmas yra veiksmingas virusų pašalinimui / inaktyvavimui. Tačiau šis kriterijus nėra absoliuti riba ir turėtų būti vertinamas holistiniu būdu kartu su inaktyvavimo kinetikos kreivėmis, moksliniu indikatoriaus viruso atrankos pagrindimu ir bendru patvirtinimo protokolo konstrukcijos patikimumu. Genų terapijos produktų atveju ypatingas dėmesys turėtų būti skiriamas kumuliaciniam klirensui visuose proceso etapuose, siekiant užtikrinti, kad bendras viruso saugumo profilis būtų priimtino lygio.

Nanofiltracijos taikymas ir iššūkiai

Viruso-sulaikomasis filtravimas (nanofiltravimas) yra svarbus viruso pašalinimo žingsnis atliekant genų terapijos produktų gryninimą. Įprastų virusus{2}}sulaikančių filtrų porų dydis yra maždaug 20 nm. Nanofiltracijos viruso pašalinimo mechanizmas visų pirma yra dydžiu{5}}pagrįstas pašalinimas, ir jis gali veiksmingai pašalinti daugumą virusų, didesnių nei membranos porų dydis, įskaitant neapvalius mažus parvovirusus, tokius kaip MVM ir PPV.

Tačiau genų terapijos produktų nanofiltracija susiduria su unikaliais iššūkiais: AAV vektorių dydis (apie 20–26 nm) yra panašus į tam tikrų indikatorinių virusų (pvz., MVM, 18–26 nm), todėl gali sumažėti vektorių atsistatymas; tušti kapsidai gali turėti įtakos filtravimo srautui ir viruso sulaikymo efektyvumui; mėginio klampumas gali žymiai padidėti didėjant vektoriaus koncentracijai. Todėl nanofiltravimo patvirtinimo SDM projekte turėtų būti visiškai atsižvelgiama į vektoriaus dalelių dydžio pasiskirstymo ir tuščių kapsidų kiekio poveikį filtravimo našumui, todėl reikėtų apsvarstyti galimybę naudoti nanofiltravimo membranas su didesnio porų dydžiu.

Chromatografijos etapų viruso klirenso įvertinimas

Jonų mainų chromatografija (IEX) yra pagrindinis AAV produktų gryninimo procesų etapas, kuriame paprastai naudojamas nukleazės skaidymas, po kurio atliekama anijonų mainų chromatografija (AEX), kad būtų užfiksuotos tuščios ir sugedusios kapsidės, arba katijonų mainų chromatografija (CEX), skirta smulkiam pilnų kapsidų gryninimui. Viruso pašalinimo mechanizmai chromatografijos etapuose apima dydžio išskyrimą, elektrostatinę sąveiką, afinitetą ir kitus veiksnius. FDA 2023 m. virusų pašalinimo simpoziume vykusiose diskusijose buvo pabrėžta, kad chromatografijos etapų virusų šalinimo efektyvumą įtakoja daugybė veiksnių, įskaitant apkrovos pajėgumą, pH, laidumą ir dervos ciklą; Visapusiškam vertinimui turėtų būti taikomas kelių faktorių stačiakampio projektavimo metodas.

Virusinės saugos kontrolė nuolatinėje gamyboje

Naujai pridėtame ICH Q5A(R2) 7 skyriuje nustatyti konkretūs virusinės saugos vertinimo nuolatinėje gamyboje reikalavimai. Genų terapijos produktų nuolatinė gamyba tapo svarbia plėtros kryptimi, tačiau tai taip pat kelia naujų virusinės saugos iššūkių. Virusinės saugos kontrolės strategijos nuolatinėje gamyboje apima: -linijoje esančius virusų barjerinius filtrus kaip svarbias izoliavimo priemones; tinkamas buvimo laiko ir proceso srautų projektavimas; inaktyvavimo etapų įtraukimas su apibrėžtu sulaikymo laiku; ir patobulintas procesų analizės technologijos (PAT) taikymas svarbių proceso parametrų stebėjimui realiuoju laiku.